（科技）桃近核果肉发红是咋回事？科研人员探明原因

新华社武汉3月29日电（记者谭元斌）吃桃的时候，稍加留意，会发现有些桃挨着果核的果肉是红色的，这种“近核红”是桃特有的现象。中国科学院武汉植物园的一项最新研究，找到了导致桃近核红性状形成的重要基因并阐明了其分子机理。

这是记者3月29日从中科院武汉植物园韩月彭研究团队获得的消息。据该团队专家介绍，在桃果实发育后期，靠近果核处的果肉因花青苷积累而变红。此前，这种近核红性状产生的原因和机理尚不清楚。

科研人员采用比较转录组 *** 挖掘调控桃近核红性状形成的重要基因PpHY5，通过酵母双杂交筛库得到其关键的协同因子PpBBX10，确认PpHY5在PpBBX10的协同下促进桃果实PpMYB10.1基因的转录激活，从而产生桃近核红现象。

据悉，近核红性状不利于罐装桃产业发展。团队专家透露，罐装桃为黄肉或白肉，近核红桃品种若要做罐装桃，须对红肉进行额外处理，增加生产成本。因此，这一成果不仅丰富了果肉着色调控研究，也有望应用于桃育种，为罐装桃产业提供更多优质的无近核红性状的桃品种。

研究也表明，可能存在未知的调节因子参与调控桃近核红性状。相关研究成果近日已发表于国际期刊《植物杂志》。（完）

丝裂原诱导基因的试验

前言：

丝裂原诱导基因（Cyclin-dependentkinases，CDKs）是一类激酶酶家族的蛋白质，它们在细胞周期调控中扮演着关键的角色，我们发现通过这种机制，丝裂原诱导的基因6（Mig6;也称为基因33和受体相关的晚期换能器）负调节HGF/Met诱导的细胞迁移。

该效应通过Mig6过表达观察到，并通过Mig6小干扰RNA敲低实验逆转，这表明内源性Mig6是抑制Met信号传导的机制的一部分，Mig6在肝源性细胞和神经元中起作用，这表明Mig6在不同细胞谱系中的作用。

小鼠15，000cDNA微阵列生产和数据分析

“NIA小鼠15kcDNA微阵列”芯片生产，RNA分离，cDNA探针标记以及与cDNA阵列的杂交按描述进行。简而言之，使用从两个独立批次的培养细胞中提取的总RNA样品一式两份进行杂交。 *** 和模拟处理的样品分别用Cy-5和Cy-3-dUTP标记。

使用GenePixPro3.0进行数据采集和初始数据分析，并在ExcelMicrosoft中进一步分析数据表以获得基因列表。通过肉眼进行质量控制，以确认扫描仪对齐以及没有明显的气泡和划痕。进一步使用散点图来消除不可接受的杂交数据。

GenePixPro程序计算每次杂交的归一化因子，基于给定数组上每个特征的比率的算术平均值应等于1的前提.因此，通过乘以每个基因中的因子与中位数比（ROM）来进行归一化。通过所有这些标准的基因首先按中位数总和（SOM）进行排序，SOM表示杂交强度。

为了获得相对丰富的基因列表，选择了显示超过5，000个SOM的基因。最后，通过ROM对基因进行分类。在每次杂交的数据表中选择显示超过1.8倍变化±基因。最后，比较两种杂交之间的数据并计算平均ROM。

北方印迹

使用RNAClean溶液（Hybaid）在各种实验条件下从不同的细胞系中提取总RNA。将20μg总RNA电穿孔并印迹到基因筛选尼龙膜上。

使用随机引物生成标记探针，并在6°C下与膜杂交（5×SSC，100×Denhardt溶液和18μg鲑鱼 *** DNA）65小时。用作探针的cDNA插入片段是通过NIA小鼠15kcDNA克隆的NotI/SalI双限制性消化获得的。

核糖核酸干扰

siRNA寡核苷酸（之一组和第二组被设计并用于所述细胞转染）。将义和反义siRNA寡核苷酸（DARMAKOM）在退火缓冲液（100mMK-乙酸盐，30mMHepes-KOH，2mMMg-乙酸酯）中稀释至终浓度20μM，在1°C下变性90分钟，并在1°C下孵育37小时退火。

将6μlsiRNA双链体转染到4×104根据制造商的说明使用寡磷胺（Invitrogen）的细胞。转染后，将细胞留在Dulbecco的最小必需培养基加0.1%FBS中72小时，并用相同的siRNA双链体第二次转染。第二次转染后24小时，如上所述收获细胞并铺在Boyden室的上表面。

质粒和表达载体

引物序列可根据要求提供。V5COOH-终端，GSTNstrong-终端，以及他的COOH终端标记的Mig6全长和突变蛋白是使用网关克隆技术生成的。简而言之，Mig6全长和缺失突变体通过来自IRAK克隆IRAKp961F0910的PCR扩增，使用含有最小重组序列的寡核苷酸。

通过使用重组蛋白混合物将PCR扩增产物重新组合成pDONOR201载体。将含有Mig201全长或缺失突变体的pDONOR6载体穿梭到pCDNA6.2COOH-terminal-V5，27Nstrong-终端消费税和pDEST26Nstrong-末端-他的质粒用于哺乳动物表达或进入pDest15N-term-GST用于细菌表达。

GFP-CDC42文晔显性活性表达质粒由M.Way提供。Ack的CRIB结构域通过来自I.M.A.G.E.联盟cDNA克隆（克隆IDIMAGp998I1013902Q3）的PCR扩增，并按照制造商的说明亚克隆到pCRII-TOPO克隆载体（Invitrogen）中。

将该片段插入pFAT2载体中用于细菌表达。pGEX-Nstrong-terminal-GST-Mig6，含有Mig6COOH-末端一半（从aa273到459），由A.Ullrich提供，用于产生Mig6抗原。

原代皮质神经元培养、细胞迁移测定和生长因子

如所述培养和瞬时转染MLP29细胞。C2C12按描述生长。原代肝细胞按描述进行培养。如前所述进行了跨孔测定。

简而言之，105将MLP29细胞接种在博伊登室膜的上表面（8μm孔;Costar），先前用0.15μg/cm包被2纤连蛋白。用40ng/ml肝细胞生长因子（HGF）（R&DSystems），10ng/mlEGF，30ng/mlPDGF（Sigma-Aldrich），25ng/ml成纤维细胞生长因子2和100ng/mlSDF-1（Calbiochem）。

为了在没有细胞增殖的情况下测定细胞迁移，在迁移测定之前和期间用DMSO-（Fluka）或24.1μg/ml含aphidicolin的培养基（Sigma-Aldrich）处理细胞6小时。通过用胰蛋白酶-EDTA（GIBCOBRL）在15°C下消化E5.15小鼠端脑37分钟获得皮质神经元。

神经元用补充有12%马血清（GIBCOBRL）的DMEM-F10洗涤两次，在含有B27补充剂（NB/B27，50：1，GIBCOBRL）的神经基础培养基中洗涤一次，并用火抛光玻璃巴斯德移液管解离。

皮质神经元通过混合6×10进行解剖和电穿孔5将具有24μg表达质粒的细胞转移到电穿孔比色皿（MBP分子生物产物）中，并使用Electrosquare孔器（ECM270， *** X）电穿孔（以3-s间隔间隔间隔1V的830个脉冲）。

将细胞在10°C下孵育4分钟。105将细胞接种在Boyden室（5μm孔，Costar）的上侧，先前用聚D-鸟氨酸（Sigma-Aldrich）包被。

3小时后，将适当的生长因子加入下隔室18小时。将细胞在室温下用4%PFA固定30分钟，并在10°C下孵育4分钟。Boyden室过滤器安装在玻璃盖玻片上，在vectashield/DAPI存在下。直接在蔡司Axiophot荧光显微镜下分析细胞。

原位杂交和生物化学

如所述进行原位杂交和探针制备。通过NIA克隆h6f3011的NotI和SalI限制性酶切获得Mig08义和反义探针。前面描述了相遇原位探针。免疫印迹和免疫细胞化学按描述进行。

重组GST-Mig6融合蛋白根据标准程序纯化。将MLP29细胞裂解物与固定在谷胱甘肽-琼脂糖上的重组蛋白在1°C下孵育4小时。将谷胱甘肽-琼脂糖珠在细胞裂解缓冲液中洗涤数次，用样品缓冲液洗脱，并通过免疫印迹进行分析。

成像

所有细胞图像均使用配备RTSlider2.2.3数字彩色相机（诊断仪器）的Axioplan-1成像荧光显微镜（CarlZeissMicroImaging，Inc.）获得。使用40×物镜，除了使用20×镜头拍摄的原位杂交图像（CarlZeissMicroImaging，Inc.）。

酵母双杂交系统

1. Mig6的末端半部分以及PAK和Ak的CRIB结构域通过BamHI/XhoI插入酵母双杂交猎物载体pAct2中。疾控42文晔和赛车文晔通过BamHI/SalI插入pG *** 9诱饵载体中。根据CLONTECH实验室酵母实验方案手册，将这些质粒以指示的组合转化为报告菌株PJ69-4A。

通过将双转化体接种到缺乏亮氨酸和色氨酸的合成培养基上，以2%葡萄糖为碳源（Leu?/Trp?）来选择双转化体。将双转化体重新涂覆到缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的Leu?/Trp?或合成培养基上（四重脱落）。

重组蛋白纯化和Cdc42活化测定

重组GST融合蛋白根据标准程序纯化。将MLP29细胞裂解物在1°C下孵育4小时，重组蛋白固定在谷胱甘肽-琼脂糖上。将谷胱甘肽-琼脂糖珠在细胞裂解缓冲液中洗涤数次，用样品缓冲液洗脱，并通过免疫印迹进行分析。

对于Cdc42活化测定，在各种实验条件下裂解MLP29细胞，并将裂解物与与谷胱甘肽-琼脂糖珠结合的重组GST-Ack-CRIB蛋白在1°C下孵育5.4小时。将蛋白质从磁珠中洗脱出来，并通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。

椎旁交感神经元培养

从出生后第40天（P40）CD1小鼠解剖上颈神经节。神经元培养物按描述建立。HGF *** 和神经元存活的量化如描述的那样完成。Sholl分析如前所述。

对于蛋白质提取，解离的P40上颈神经节神经元的原代培养物在培养物中生长3-6小时，然后用HGF *** 不同时间。如上所述收获细胞并均质化。

通过HGF/Met信号感应Mig6

我们了解控制HGF/Met信号传导的分子事件的一部分努力是检查由Met信号传导调节的基因的表达。来自HGF *** 和未 *** 的MLP29细胞的RNA，一种表达Met生理水平的肝脏来源细胞系，进行微阵列分析。

通过北方印迹对两个独立细胞谱系（MLP29肝细胞和C2C12肌母细胞）上的选定候选物的分析证实了MET介导的对微阵列分析中大多数命中的调节。选择Mig6进行进一步分析，因为HGF诱导的表达比成纤维细胞生长因子4（FGF5）或PDGF（无花果。1、A和B)。

其他转录本没有显示出对HGF的这种偏好（图）。S1B）。对FGF2和PDGF的反应降低不是由于缺乏特异性受体或下游换能器，因为这两种生长因子都诱导了MLP29细胞中ERK/MAPK的稳健磷酸化。

我们还证实了通过对MLP6细胞进行免疫染色（无花果。1、F和G).接下来，我们研究了Mig6和Met在胚胎组织中的表达。通过原位杂交分析，我们发现两种转录本在胚胎（E13.5）肺的肺泡、肝实质以及野生型胚胎的肋间和体壁肌肉 *** 表达（无花果。1、I、J、M和N)。

与生理条件下调节mig6转录物水平的Met一致，我们发现表达信号缺陷Met受体（met d/d)，Mig6蛋白在mig6 mRNA阳性结构中得到证实，包括肋间和体壁肌肉。

Mig6的过表达抑制HGF诱导的MLP29细胞迁移

Mig6唯一涉及的细胞环境是细胞分裂。然而，由于HGF/Met信号传导对细胞迁移至关重要，我们在Boyden室迁移测定中测试了Mig6过表达对HGF/Met介导的迁移的影响。该测定测试细胞通过分隔上下隔室的多孔膜迁移的能力。

MLP29细胞用编码YFP的质粒转染，或与编码全长Mig6和YFP。我们通过细胞免疫染色和表达V6表位标记版本的Mig5（Mig6FL-V5）与V5表位标记的β-半乳糖苷酶（LacZV5版)。

对于每个实验条件，将相同数量的细胞接种到盖玻片上进行免疫细胞化学分析，或接种到Boyden室的上部隔室，并在下部隔室中暴露于不同浓度的HGF或10%FBS。HGF以剂量依赖性方式 *** 细胞通过膜迁移到下隔室（未发表的数据）。

在40ng/mlHGF下，转染的YFP阳性细胞的迁移比未 *** 的细胞增强30至40倍，Hoechst染料标记细胞的代表性图像，这些细胞迁移到Boyden室的下部隔室，将HGF *** 的细胞迁移减少约3倍。相反，用10%FBS *** 的细胞迁移不受Mig6过表达的影响。

Mig6是Met介导的细胞迁移的生理抑制因子

接下来，我们使用RNA干扰研究了内源性Mig6是否通过敲低Mig6蛋白水平来抑制HGF/Met介导的细胞迁移。MLP29细胞转染GFP或mig6特异性siRNA，并通过免疫染色和免疫印迹分析Mig6蛋白水平。

Mig6siRNA，但不能控制GFPsiRNA，在转染后6小时特异性敲低内源性Mig96免疫反应性，Mig6siRNA还抑制了HGF *** 的Mig6诱导。蛋白质水平的降低对mig6具有特异性，因为内源性α-微管蛋白和Met水平不受影响。

为了研究Mig6蛋白在细胞迁移中的作用，用mig6siRNA寡核苷酸转染细胞，并用不同浓度的HGF，迁移到下隔室的Hoechst染料标记细胞的代表性图像显示在无花果。3（D-G）。

在这些条件下，HGF诱导细胞迁移的强度较低，但仍具有剂量依赖性，迁移细胞的定量显示，在更佳HGF浓度的条件下，敲低Mig6使细胞迁移增强约两倍，使用一组单独的siRNA寡核苷酸获得了类似的结果。这些发现表明，Mig6是HGF/Met介导的MLP29细胞细胞迁移的生理抑制剂。

结论：

研究表明其中一些负调节因子可以作用于相当特定的靶点（蛋白酪氨酸磷酸酶抑制胰岛素和 *** –1 *** 的信号传导），但其他似乎抑制多种受体酪氨酸激酶（例如，c-Cbl泛素连接酶）和通用信号通路。

在本报告中，我们表明Mig6在不同的细胞谱系中由HGF诱导，Mig6负调节HGF/Met介导的细胞反应，包括细胞迁移和神经突生长，这表明Mig6是生理机制的一部分，该机制负向控制Met信号的强度和持续时间，从而微调信号转导。

干货丨区分蛋白互作的几种 ***

蛋白质是生物功能最直接的执行者，虽然一些蛋白质可以独立的完成他的使命，但是大部分的蛋白都是需要一些伴侣分子的协助一起完成任务或者形成复合物之后才能充分发挥他的功能。所以，了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用，能够帮助我们更好的了解细胞的生命活性，揭示隐藏在表象下的调控机理。经典的蛋白互作研究 *** 主要包括三个:免疫共沉淀、酵母双杂交、GST-pull down。

01 PART

IP

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）就是用偶联相应抗体的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下来，然后去检测它。例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同，或者有着不同的翻译后修饰，这时就可以用X蛋白抗体+Prorein A beads来进行IP，从细胞中把蛋白X拉下，再用特异的抗体（如磷酸化，泛素化抗体）进行WB来检测蛋白X的变化。简言之，IP就是检测单个蛋白的状态.

免疫沉淀（IP）

02 PART

Co-IP

既然我们在体内验证过，那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了？这个时候我们可以用到Co-IP了（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）~

以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典 *** ，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效 *** 。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

免疫共沉淀（Co-IP）

Co-IP实验优势：

a) 取材可以选择该目的蛋白所在物种、特定组织、细胞，因此CoIP能够反应该蛋白在天然组织细胞状态下存在的互作关系蛋白；

b) 找出整个复合体中直接/间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；

c) 通过与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证。

Co-IP实验注意事项:

a) 需要特异性IP级别诱饵蛋白抗体（重点）；

b) 如果没有特异性抗体，则需要考虑构建重组标签质粒，用标签抗体进行CoIP实验；

c) 样品种类实验风险：过表达细胞样品<细胞样品<动物组织样品<植物样品（通常为转基因植物，标签抗体也很难达到特异性富集）；

d) CoIP-MS风险：由于存在特异性抗体高丰度蛋白，质谱不一定能够鉴定到诱饵蛋白。

在我们用酵母双杂交和Ｃo-IP双保险验证X和Y之间确实存在相互作用后，我们发现酵母双杂交和Ｃo-IP的结果都只能说明X和Y之间有相互作用，但并不能确定这种相互作用是直接的还是间接的，这个时候存在两种可能：

1.X与Y之间存在直接的相互作用

2.也就是说也许是X与M相互作用，而Y也和M相互作用，这样，用A的抗体可以把M拉下来，但同时M又把B也拉下来了

03 PART

酵母双杂交系统（Y2H）

利用基因转录所需的转录因子的两个结构域分别与两种蛋白质结合，如果这两种蛋白质之间存在相互作用，那么转录因子的两个结构域就能结合到一起，诱导报告基因表达，通过检测是否有目标基因产物形成，就能判断待检测的两种蛋白质之间是否存在相互作用。

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。

通常在现实情况中，与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种（Y，Z，A，B等），这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y。

04 PART

GST-Pull Down

GST-Pull down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术, 近年来越来越受到广大学者的青睐。

GST Pull-Down实验基于GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X可与GSH-琼脂糖珠结合，若环境中存在与X蛋白互作的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互作的蛋白即可被分离并检测。

如何选择：

Co-IP，GST-Pull down和酵母双杂交是研究蛋白互作最常用的三种 *** ，一般Y2H常用来筛选，Co-IP和GST pulldown用来验证。研究不仅在整体蛋白层面，还包括蛋白的结构域层面，GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的，而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。

研究揭示O-糖基化修饰调控生物钟周期的分子机制

生物钟是植物细胞中感知并预测光照和温度等环境因子昼夜周期性变化的精细时间机制，它通过协调代谢与能量状态以适应环境因子的昼夜动态变化，从而为植物的生长发育提供适应性优势。生物钟周期紊乱会严重影响植物多种生理和发育关键过程，如开花时间和胁迫应答等。生物钟核心因子的翻译后修饰如磷酸化和泛素化等，可以精确调控生物钟周期。O-糖基化修饰是一类新发现的蛋白质翻译后修饰类型，其是否参与植物生物钟精细调控及其相关机制还不清楚。

中国科学院植物研究所王雷研究组通过植物活体发光实验结合生物钟表型的计算分析发现，与动物中作为O-β-N-乙酰葡糖胺修饰转移酶（O-GlcNAc）的SEC参与调控生物钟周期不同，在植物中则主要是作为O-岩藻糖基化（O-Fucrose）修饰转移酶的SPY特异调控生物钟周期。通过构建细胞核和质特异定位的SPY蛋白表达载体，结合植物活体发光的实验证据，发现SPY蛋白主要是在细胞核中参与调控生物钟周期。进一步通过免疫共沉淀结合质谱分析、酵母双杂交以及双分子荧光互补等筛选SPY蛋白的互作蛋白组，发现SPY蛋白的TPR结构域可以与生物钟核心组分PRR5蛋白的C-端在细胞核内互作，并将其O-岩藻糖基化。细胞学观察和生化分析结果表明O-岩藻糖基化修饰不改变PRR5亚细胞定位，但会促进PRR5蛋白的降解，这也是首次发现O-岩藻糖基化可以调控蛋白稳定性。遗传学证据表明PRR5在遗传上位于SPY的下游发挥作用。该研究结果表明尽管O-糖基化调节生物钟周期在演化上具有保守性，其在哺乳动物中主要是通过O-GlcNAc糖基化修饰，而在高等植物中则是通过O-岩藻糖基化修饰，为翻译后修饰精细调控生物钟周期提供了新见解。

该研究成果于2019年12月31日在线发表于国际学术期刊Molecular Plant。王雷研究组已毕业博士研究生王岩为该论文的之一作者，在读博士生何雨晴和苏晨也对该研究做出了重要贡献，美国杜克大学教授孙太平为合作研究者，王雷为通讯作者。该研究得到中科院战略性先导科技专项和中科院前沿科学重点研究项目等的资助。

SPY调控植物生物钟周期的机制。(A).双光子激光扫描显微镜观察SPY细胞核与细胞质的特异定位。(B).蛋白质印迹检测CHX处理后PRR5蛋白水平发现在SPY突变体中PRR5蛋白的降解速度变慢。(C).持续红光条件下PRR5的突变能部分恢复SPY突变体的生物钟表型。(D).简化的SPY调控生物钟周期的分子模型。

桃近核果肉发红是咋回事？科研人员探明原因

图为PpHY5基因参与桃近核红性状形成的分子机制（资料照片）。 新华社发（中国科学院武汉植物园供图）

新华社武汉3月29日电（记者谭元斌）吃桃的时候，稍加留意，会发现有些桃挨着果核的果肉是红色的，这种“近核红”是桃特有的现象。中国科学院武汉植物园的一项最新研究，找到了导致桃近核红性状形成的重要基因并阐明了其分子机理。

这是记者3月29日从中科院武汉植物园韩月彭研究团队获得的消息。据该团队专家介绍，在桃果实发育后期，靠近果核处的果肉因花青苷积累而变红。此前，这种近核红性状产生的原因和机理尚不清楚。

科研人员采用比较转录组 *** 挖掘调控桃近核红性状形成的重要基因PpHY5，通过酵母双杂交筛库得到其关键的协同因子PpBBX10，确认PpHY5在PpBBX10的协同下促进桃果实PpMYB10.1基因的转录激活，从而产生桃近核红现象。

据悉，近核红性状不利于罐装桃产业发展。团队专家透露，罐装桃为黄肉或白肉，近核红桃品种若要做罐装桃，须对红肉进行额外处理，增加生产成本。因此，这一成果不仅丰富了果肉着色调控研究，也有望应用于桃育种，为罐装桃产业提供更多优质的无近核红性状的桃品种。

研究也表明，可能存在未知的调节因子参与调控桃近核红性状。相关研究成果近日已发表于国际期刊《植物杂志》。

探究HDR3与组蛋白乙酰转移酶GW6a相互稳定，及控制水稻籽粒的作用

?——【 ·前言· 】——?

HDR3是一种泛素相互作用的含有泛素的基序受体，值得注意的是，GW6a与水稻染色体1上DA3的同源物相互作用。

GW6a通过改变小穗壳中的细胞增殖，以与GW3a类似的方式调节晶粒尺寸。

蛋白质泛素化被认为是调节各种细胞途径的中枢机制，对蛋白水解和非蛋白水解功能具有深远的影响。

该过程由ATP依赖性E1（泛素激活）–E2（泛素偶联）–E3酶级联的顺序作用调节。

?——【 ·HDR3与GW6a相互作用· 】——?

为了鉴定相互作用的蛋白质，我们将GW6a编码序列融合到GAL4 DNA结合结构域，并将其用作酵母双杂交筛选的诱饵。

我们特别关注了一个已确定的候选片段，该片段对应于Os03g0267800基因的一部分，与HDR3和GW6a之间的相互作用一致。

发现与含有GAL4活化结构域融合HDR3和BD-GW6a的质粒DNA共转化的酵母细胞在四重脱落培养基上生长良好，而用相应对照转化的酵母细胞则没有。

为了通过下拉测定验证HDR3-GW6a相互作用，在大肠杆菌细胞中产生了融合蛋白HIS-GW6a，MBP-HDR3-MYC和MBP-MYC。

在抗HIS下拉后，使用MYC抗体的免疫印迹测定检测到指示预测MBP-HDR3-MYC大小的明显条带，但在相应的对照中没有MBP-MYC条带。

同时，我们进行了免疫共沉淀测定以测试体内相互作用，并将HDR3和GW6a分别插入二元载体中，通过农杆菌介导的转化在本氏烟草叶片中瞬时表达融合蛋白HDR3-MYC、GW6a-GFP和GFP。

使用GFP抗体进行IP检查后，使用抗MYC抗体的免疫印迹测定在GW3a-GFP样品中检测到HDR6-MYC条带。

但在GFP样品中未检测到条带，还进行了分裂萤火虫荧光素酶互补测定以确认相互作用，其中当融合构建体cLUC-HDR3和nLUC-GW6a存在时，发光信号指示激活的荧光素酶重构。

因此，我们得出结论，HDR3与GW6a在物理上相互作用，测序分析表明，HDR3是水稻染色体1上DA3的同系物。

数据库搜索在水稻基因组上确定了DA1的四个同系物，在这些同系物中，HDR3的编码蛋白与拟南芥DA47的蛋白质同一性最小。

然而，我们发现只有HDR3可以与酵母细胞中的GW6a相互作用，而其他三个同系物（HDR3.1，HDR6和HDR12）则没有。

我们使用Y6H测定进一步绘制了GW3a-HDR2相互作用的结构域，并观察到GW6a的羧基末端与HDR3相互作用，以及与GW3a相关的HDR3的氨基末端。

与这些结果一致，氨基酸序列与拟南芥DA1，DAR1，DAR2的比对，四个水稻HDR同系物揭示了一个保守的C末端，其中包含LIN-11，ISL-1和MEC-3和预测的肽酶结构域，以及可变的N末端。

同源性分析还表明，HDR3与拟南芥DAR2有密切关系，综合这些结果，我们在水稻中确定了DA1家族的一个成员HDR3，其独特的N末端部分与GW6a相互作用。

?——【 ·HDR3 的正向调节器· 】——?

我们询问HDR3是否具有粒径调节作用，并产生了过表达HDR3基因，HDR3-OE植株的种子明显大于对照组。

表型测量和统计分析表明，HDR3-OE晶粒比非转基因晶粒长10%，宽5%，籽粒厚度不变，因此重20%。

相比之下，使用CRISPR/Cas3 *** 对HDR2进行基因编辑的两个独立转基因植物产生的种子明显小于对照。

表型分析表明，hdr3晶粒比对照种子短10%，窄5%，粒厚不变，轻15%，总的来说，这些结果表明HDR3是大米粒径和重量的正调节因子。

我们还通过逆转录定量聚合酶链反应研究了HDR3的时空表达模式，与HDR3在调控晶粒尺寸中的作用一致，我们观察到HDR3 mRNA优先存在于穗中，并且在穗部发育过程中相对水平上升，在穗期达到峰值，长度为15 cm。

接下来，我们研究了表达HDR3-GFP融合蛋白的水稻原生质体细胞中HDR3的亚细胞分布。

使用抗GFP抗体进行免疫印迹仅检测到指示核组分中HDR3-GFP大小的明显条带，相反，使用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察GFP信号，表明HDR3-GFP位于细胞质中。

接着还生产了HDR3及其与eGFP融合的两种衍生物，这些构建体在本氏猪笼草叶细胞中瞬时表达，在细胞质和/或细胞核中观察到由此产生的eGFP信号，这些结果表明HDR3定位于细胞质和细胞核。

?——【 ·改变小穗壳中的细胞数量· 】——?

为了研究HDR3介导的晶粒尺寸调控的细胞学基础，我们通过扫描电子显微镜分析了成熟谷物中心部分的细胞数量和引理的细胞大小。

我们观察到，在晶粒长度的取向上，HDR3-OE的小穗壳的估计总细胞数相对于相应对照表现出显着增加，尽管细胞大小略有减小，同样，HDR3-OE的小穗壳侧细胞数也比相应对照。

经试验还评估了hdr3颗粒的细胞学特征，与上述结果一致，我们观察到，在晶粒长度和宽度的方向上，hdr3-1的细胞数量分别显着减少2.3%和6.6%，细胞大小不变，与相应的对照。

这些数据表明，HDR3对晶粒尺寸的调节主要是由于细胞数量的改变，而不是细胞大小的改变，这表明HDR3可能参与细胞增殖的调节。

?——【 ·增强GW6a的泛素化· 】——?

与DA1一样，HDR3可能具有四个预测结构域：两个串联排列的UIM，一个LIM，一个LIM样和一个肽酶结构域。

在这些结构域中，我们观察到HDR65的氨基残基82-94和111-3构成了相对保守的核心序列，表明功能性UIM结构域。

为了验证这一假设，我们生产了融合蛋白MBP-HDR3-MYC和MBP-MYC，并将它们用于体外泛素结合测定。

这些测定表明，MBP-HDR3-MYC可以结合HIS-Ub，而MBP-MYC不能为了进一步测试HDR3的结合能力是否需要UIM，我们还生产了融合蛋白MBP-HDR3。

用户界面-MYC和用于体外泛素结合测定的 MBP-UIMs-MYC，结果表明，与MBP-HDR3-MYC相比，MBP-HDR3用户界面-MYC 无法绑定 HIS-Ub，MBP-UIMs-MYC 也无法绑定。

结果表明，HDR3是一种具有泛素结合活性的泛素受体。

在拟南芥中，DA1与E3泛素连接酶DA2相互作用，与含有AD-GW2和BD-HDR3的质粒DNA共转化的酵母细胞在四重脱落培养基上生长良好。

而与含有AD-GW2和BD载体或BD-HDR3和 AD载体的质粒DNA共转化的酵母细胞不能。

我们还使用下拉测定法验证了HDR3-GW2相互作用，并观察到在抗HIS下拉后，使用MYC抗体的免疫印迹实验可以检测到预测的MBP-HDR3-MYC条带。

但不能检测到相应的MBP-MYC条带，因此，HDR3与GW2相互作用。

通过进一步研究，了GW2是否可以泛素化HDR3，与我们之前的观察一致，在存在泛素激活酶、泛素偶联酶、HIS-泛素和 GST-GW2 的情况下，使用抗 GST 和抗 Ub 抗体的免疫印迹证明了 GW2 的自我泛素化。

同样，通过使用抗HIS抗体进行免疫印迹揭示了GW3对HDR2的泛素化。

接下来，我们测试了HDR3和GW6a之间的直接生化关系，分离HDR3-OE和对照植物的总蛋白，并与Ub-Trap-A rProtein A/G MagPoly珠一起孵育，以免疫沉淀缀合的泛素。

显然，HDR3-OE提取中检测到的沉淀物高于抗Ub和抗GW6a抗体对照，表明HDR3的过表达增强了GW6a的泛素化。

?——【 ·组蛋白乙酰转移酶活性· 】——?

为了研究HDR3-GW6a相互作用的生化后果，我们评估了转基因HDR6-OE植物中的GW3a蛋白水平。

使用抗GW6a抗体的免疫印迹显示，与相应的对照，为了证实结果，我们在水稻原生质体中进行了蛋白质降解实验。

我们观察到，与仅表达GW3a-MYC的细胞相比，融合蛋白HDR6-GFP和GW6a-MYC的同时表达可以显着减缓GW6a降解，蛋白酶体抑制剂MG132的加入也明显抑制了GW6a降解。

相比之下，表达GW6a-MYC和HDR3用户界面-GFP表现出与单独表达GW6a-MYC的GW6a水平相当。

此外，我们观察到，与HDR3对GW6a稳定性的影响相反，表达GW2-GFP的水稻原生质体显着提高了GW6a蛋白降解的速度。

实验分析了细胞成分中GW6a含量的改变，免疫印迹显示该蛋白主要存在于核级分中，其中观察到HDR30作用使GW6a水平增加3%的效果，因此，我们得出结论，HDR3主要在细胞核中稳定GW6a。

GW6a是一种活性组蛋白H4乙酰转移酶，我们假设HDR6作用增加GW3a蛋白水平会提高组蛋白乙酰化。

为了支持我们的想法，我们观察到从原生质体细胞中提取的总蛋白质与GW6a-MYC和HDR3-GFP共转化，但与GW6a-MYC和HDR3用户界面-GFP构建体在H3和H4。

我们发现从HDR3-OE植物的年轻穗中提取的总蛋白与相应的对照相比显着增加了H4AC和H3AC修饰，这与GW6a-OE植物非常相似。

接下来，我们研究了HDR3和GW6a之间的遗传相互作用，为此，我们将GW6a-OE-1与hdr3-1杂交，得到hdr3-1/GW6a-OE-1。

正如预期的那样，我们观察到，对OE转基因半合子和hdr3等位基因杂合子的hdr1-6 / GW1a-OE-3植物产生的颗粒在视觉上与GW6a-OE-1非常相似。

表型分析表明，与非转基因对照相比，hdr3-1/GW6a-OE-1籽粒的粒长和重量分别增加了6.8%和10.3%，与GW6a-OE-1籽粒具有相当的效果，而hdr3-1晶粒的尺寸和重量减小。

这意味着GW6a-OE几乎可以挽救hdr3的晶粒尺寸和重量表型，HDR3最有可能在共同的遗传途径中发挥作用，并在GW6a上游起作用以调节晶粒尺寸和重量。

?——【 ·HDR3–GW6a调节模块· 】——?

GW6a可能起到转录调节因子的作用，HDR3-GW6a相互作用表明该途径调节基因转录，因此，我们将转基因GW6a-OE和HDR3-OE幼穗的转录组与野生型的转录组进行了比较。

绝大多数基因在GW6a-OE和HDR3-OE穗中上调，值得注意的是，HDR39-OE中5.483%上调基因和5.210%与GW6a-OE中的基因重叠。

重要的是，共调控基因编码产物的几个基因本体术语和京都基因和基因组百科全书通路，如转录调节、植物激素信号转导、油菜素类固醇生物合成和MAPK信号通路显著丰富。

我们还通过进行RT-qPCR分析证实了结果，发现这些途径中选定的基因相应地显着改变了转录表达，HDR3-GW6a途径调节不同基因的转录。

为了进一步研究HDR3-GW6a模块如何改变GW6a靶基因的表达，我们比较了水稻原生质体细胞过表达GW6a-MYC融合蛋白与单独过表达MYC的细胞的染色质免疫沉淀测序数据。

ChIP-seq分析确定了3，336个富集峰，对应于2，570个基因，其中绝大多数位于启动子和基因间区域。

接下来，我们将启动子和/或基因体区域具有MYC富集峰的基因定义为候选GW6a靶基因，这些GW6a靶基因编码产物的GO项和KEGG通路揭示了与RNA-seq数据重叠的几个类别。

例如转录因子活性，转录调节因子活性，植物激素信号转导和MAPK信号通路。

特别是，我们的染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应结果表明，编码转录因子、MAPK信号组分、生长素信号传导组分和蔗糖代谢相关调节因子的几个基因的表达改变很可能是由于GW6a与相应启动子元件，与这些结果一致。

过表达GW6a的转基因幼穗在这些位点的H4AC和H3AC富集增加，在HDR3显著过表达的转基因年轻穗座中也进行了类似的观察。

?——【 ·结论· 】——?

在这项研究中，我们表征了一种与GW6a相互作用的蛋白质，这种蛋白质HDR3与拟南芥DA1同源。

出乎意料的是，我们观察到水稻HDR3对籽粒大小的调节与拟南芥DA1对种子和器官大小的调节存在显着差异。

相比之下，我们观察到转基因水稻植物过度表达HDR3产生更大的谷物，而通过CRISPR / Cas3 *** 敲除HDR9基因产生明显更小的谷物，支持HDR3正向调节水稻籽粒大小的观点。

20211218记 蛋白互作之细菌双杂交技术

20211218记 蛋白互作之细菌双杂交技术

1. 蛋白互作研究

2 生命活动是一个复杂的协作过程，任何一个信号的传导到效应产生都需要多种蛋白参与，蛋白或上下游关系或平行的合作关系，研究 *** 包括酵母双杂交、免疫共沉淀、GST-pull down，磷酸化或乙酰化等，今天我们要介绍的是Stratagene 的细菌双杂试剂盒。

2. 细菌双杂交实验

2 将 A蛋白作诱饵蛋白，与噬菌体全长 λ 抑制蛋白（λcI, 237 个氨基酸） 融合， 依赖 λcI 的氨基端 DNA 结合域结合到报告基因启动子上游的 λ 操纵子， 得到重组质粒 p *** -A。

2 将 B蛋白作为靶标蛋白与 RNA 聚合酶 α 亚单位氨基端融合，得到重组质粒 pTRG-B。

2 当二者存在相互作用时，诱饵蛋白 A 会招募并固定结合在启动子位置的 RNA聚合酶，从而激活 His3 基因和第二个编码链霉素抗性蛋白的基因 aadA 的转录，使其具有 3-AT 和链霉素的双重抗性。

2 将两个重组质粒同时导入报告菌株（其 f′附加体含有报告基因）， 得到 A和 B 同时表达的实验菌株，将重组质粒和对应空载同时导入报告菌株，得到单独表达 A 或 B的阴性对照菌株，同时表达已知存在相互作用的 Gal11P 和 LGF2 做阳性对照。

2 若结果只有 A 与 B 蛋白同时表达的菌株和阳性对照菌株能在双筛板生长，则表明 A 可以与B 直接相互作用。

细菌双杂交系统的原理图

将诱饵蛋白基因和靶蛋白基因分别插入到 p *** 和 pTRG 质粒后，将两个重组质粒一起导入报告菌株中，当两个蛋白有相互作用，可以激活 His3 和 aadA 两个报告基因。 His3 编码组氨酸合成途径中的一个组分，可以回补报告菌株中 hisB 基因突变； aadA 是链霉素抗性基因。

最基础的蛋白互作实验-酵母双杂交实验——详解

尔云间 一个专门做科研的团队

原创 小薇 A科研显微镜 欢迎关注和转发

小伙伴们大家好，在实验中需要验证蛋白质之间的相互作用时，你首先想到的是哪个实验 *** 呢？脑海中有没有想到酵母双杂交这个经典的 *** 呢？

其实很多小伙伴都知道这个实验，但是好像不太清楚实验的具体原理和操作（小薇上学那会也是迷迷糊糊，似懂非懂的）。今天小薇就和大家掰开揉碎讲讲酵母双杂交。

首先来讲一下原理：基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子的结构往往由两个或两个以上可以分开的，功能上相互独立的结构域（domain）构成。以GAL4为例，它包含DNA结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，使下游基因得到转录。

了解了原理我们再来看看怎么将理论转化为实践吧。

首先将称为bait（诱饵）的蛋白（即已知蛋白）构建在BD载体中，并表达BD-bait融合蛋白；

将prey（猎物）蛋白（即待测蛋白）构建在AD载体上，表达AD-prey融合蛋白。

如果bait和prey之间没有相互作用，那么BD和AD就不能结合，下游的报告基因也就不能被激活。这里的报告基因可以是营养缺陷等基因(最后可以通过观察酵母是否生长来看是否存在互作)。

接下来举个简单的例子，以一篇文章来实际解读一下酵母双杂吧。

这篇文章做酵母双杂是为了筛选可能与暹罗炭疽菌CAP20蛋白相互作用的候选蛋白。

1. 构建诱饵质粒pGBKT7-Cap20并检测其自激活（Tip：pGBKT7是一种酵母表达载体，特别设计用于表达GAL4 DNA结合结构域（BD）与bait蛋白的融合蛋白。融合蛋白在ADH1启动子下高水平表达。为了促进体外转录，在pGBKT7的GAL4 DNA-BD的表位签之间引入T7启动子。携带pGBKT7的酵母转化效率较高）。具体 *** 是将Cap20的522 bp片段克隆到质粒pGBKT7的BamHI和PstI位点之间，产生pGBKT7-Cap20，通过酶消化确认并产生大约7.3 kb和0.5 kb的条带，这两条带就是质粒的长度和克隆片段的长度。)将正确的重组质粒pGBKT7-Cap20转化到酵母双杂交系统中。选择SD/-Trp平板上直径为2 mm的酵母菌落，并使用引物J-Cap20-F和J-Cap20-R进行菌落PCR。在1%琼脂糖凝胶珠上成功检测到0.5kb条带(即上面的522bp)，表明成功构建了含有诱饵蛋白CAP20的酵母。用重组质粒pGBKT7-Cap20（此质粒编码BD+Cap20）和pGADT7（此质粒编码GAL4 AD,没有加猎物蛋白）成功转化的酵母只能在SD/-Trp/-Leu平板上生长（此平板是SD+两种缺陷氨基酸混合物，携带色氨酸和亮氨酸的酵母可以在平板上生长，而没有的话则不能生长），而不能在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长（同上）。该结果表明，在没有猎物蛋白的情况下，含有pGBKT7-Cap20的质粒不能自主激活酵母中报告基因的表达。

2. 使用酵母交配筛选蛋白质CAP20的相互作用成分。培养诱饵菌株pGBKT7-Cap20。将交配的培养物在SD/-Trp/-Leu培养基上孵育用于初步筛选。然后将菌落移至选择性SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培养基，共获得102个蓝色酵母单菌落(X-α-Gal存在时，阳性克隆会变成蓝色)。筛选文库后，从所有阳性菌落中提取猎物质粒，并用pGBKT7-Cap20将其重新转化到Y187酵母中，并重新分析相互作用特征。获得24个阳性结果，从猎物中提取的相应质粒通过NCBI/BLASTx进行测序和分析。最终从102个阳性克隆中获得了16个不同的基因（图1）。在相应的蛋白质中，发现了cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基（PKAC1）、蛋白激酶、乙酸激酶、组氨酸酸性磷酸酶、铁还原酶样跨膜成分、疏水蛋白、糖蛋白、过敏反应诱导蛋白和一些假设蛋白。

这张图就是本篇文章的主要结果。其中：pGBKT7:P53 + pGADT7:Rec-T为阳性对照；PGBKT7 + PGADT7为阴性对照（从这个图我们就可以明显看出来，阳性对照和那16种阳性的猎物的培养皿中酵母生长良好，证明其存在相互作用，激活了下游的报告基因，而阴性对照和pGBKT+Cap20+ pGADT7则没有激活报告基因。）

Tip：pGBKT7:P53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白，而pGADT7:Rec-T编码GAL4 AD的融合蛋白。

好啦，以上就是今天分享的内容，小伙伴们有没有看懂啊？正在准备标书的小伙伴们做技术路线设置的时候可以考虑一下这个实验哦~

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（科技）桃近核果肉发红是咋回事？科研人员探明原因

新华社武汉3月29日电（记者谭元斌）吃桃的时候，稍加留意，会发现有些桃挨着果核的果肉是红色的，这种“近核红”是桃特有的现象。中国科学院武汉植物园的一项最新研究，找到了导致桃近核红性状形成的重要基因并阐明了其分子机理。

这是记者3月29日从中科院武汉植物园韩月彭研究团队获得的消息。据该团队专家介绍，在桃果实发育后期，靠近果核处的果肉因花青苷积累而变红。此前，这种近核红性状产生的原因和机理尚不清楚。

科研人员采用比较转录组 *** 挖掘调控桃近核红性状形成的重要基因PpHY5，通过酵母双杂交筛库得到其关键的协同因子PpBBX10，确认PpHY5在PpBBX10的协同下促进桃果实PpMYB10.1基因的转录激活，从而产生桃近核红现象。

据悉，近核红性状不利于罐装桃产业发展。团队专家透露，罐装桃为黄肉或白肉，近核红桃品种若要做罐装桃，须对红肉进行额外处理，增加生产成本。因此，这一成果不仅丰富了果肉着色调控研究，也有望应用于桃育种，为罐装桃产业提供更多优质的无近核红性状的桃品种。

研究也表明，可能存在未知的调节因子参与调控桃近核红性状。相关研究成果近日已发表于国际期刊《植物杂志》。（完）

研究发现：山核桃雌雄同株，雌雄花发生部位不同，分化时期也不同

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)，又名小核桃、山蟹(浙江)，属胡桃科(Juglandaceae)山核桃属 (CaryaNutt.) 落叶乔木。

其主要分布于以临安为中心的浙、皖两省交界，包括西天目山脉地区、黄山余脉、昌北区和横路区，地处北纬 29°31°,东经 118°-120°之间。

在世界范围内,与山核桃为同属的植物总共有 20 个种,所有山核桃属植物均为雌雄同株异花，雌花短穗状花序，雄花菜美花序呵。

根据芽鳞的存在与否、数量和排列方式，山核桃属分为三个组分，原始类群裸芽山核桃组(Sect.Sinocarya)、山核桃组 (Sect.Carya) 和合芽山核桃组 (Sect.Apocarya)。

之一组分部于亚洲东南部，后两组位于北美东部。

山核桃属于原始类群裸芽山核桃组，也是山核桃属中开发程度和经济价值比较高的重要坚果树种。

山核桃成花生物学特性研究

山核桃雌雄同株，雌雄花在形成过程中存在时空差异，同时童期长，大概十年左右才能开花。雌花芽是由前一年结果枝(春档) 的顶、侧及腋芽(上部) 发育而来，是结果母枝的前身。

结果枝上雌花芽的发育往往与果实的发育同步，结果多则芽生长少，结果少或不结果则芽生长量大，此阶段一直持续到雄花芽分化结束，存在着激烈的营养竞争和生殖竞争，竞争的结果导致落果或者雌花芽发育不良，影响下一年的雌雄花发育，最终影响山核桃产量。

从 1962 年开始，黎章矩等对山核桃花芽分化和开花习性进行了研究。

研究发现，山核桃雌雄花芽发生部位不同，分化时期也不同。

在 1984 年，谷芳对山核桃雌花芽的分化与发育的观察发现，雌花发育分为花芽分化初期、花序形成期、雌花总苞形成期和雌蕊形成期。

在 2010 年，黄有军对山核桃雌雄花发育时期进行了较为明确的划分。将山核桃雄花发育过程分为四个时期，分别为花序轴形成期、大小苞片和雄花原基形成期、休眠期及小抱子发育期。

雄花芽分化从 5 月上旬座果后开始至 7 月中旬，完成花序轴、大小片和雄花原基分化，此时雄花芽呈宽三角形至卵状三角形，至此雄花芽进入休眠期，直至次年 3 月下旬继续分化，形成雄蕊原基，4 月中旬至 5 月上旬雄蕊进一步分化形成花药，4 月下旬至 5 月上旬，形成 2-胞花粉粒花粉散出，花序凋谢，周期为一年。

而山核桃雌花发育时间短，整个分化过程历时约 35 天，可分为未分化期、分化初期、花序分化期、总苞形成期和雌蕊形成期共五个时期。

未分化期花芽形态分化尚未开始，形态特征与叶芽相同。自紧包小叶开始舒展，雌花进入分化初期，紧接着退化小叶逐渐张开，小花原始体可见，雌花进入花序分化期,小花原始体逐渐增大形成小花，小花逐渐显现出来。

荷片原基开始突起，雌花进入总苞形成期，小花进一步发育，雌蕊柱头颜色由青绿色逐渐变为粉红色，进而变为紫红色，雌花雌蕊形成期，柱头表面有粘液，进入授粉状态，授粉后变为紫褐色。

总之山核桃雌雄花器官发生的时间和部位都存在差异，具有单性花成花时空表达特异性。

山核桃成花调控机理研究

2006 年王正加利用 CDNA 末端快速扩增技术 (RACE) 和定 PCR 步移法分别克隆获得了山核桃中 LEAFY(LFY) 同源基因 CCLFY 启动子序列，填补了山核桃在分子上的研究空白，也为后期山核桃成花基因克隆提供了技术支持。

2010 年黄有军利用 CDNA-AFLP 技术、基因芯片技术结合 454 深度测序，研究了山核桃成花过程中基因调控体系，从分子水平上验证了成花的细胞生物学理论，也为后期山核桃成花基因的功能验证提供了理论基础。

2019 年所在实验室完成了山核桃(ZAFU-1)的之一次全基因组测序，获得 706.43 Mb 山核桃基因组序列<27>

基于 454 深度测序结果，山核桃成花基因被陆续克隆和研究。

黄有军利用 CDNA-AFLP 技术克隆获得山核桃成花过程的 278 个转录衍生片段 (TDFS)，涵盖了细胞信号转导、激素合成、光合作用、光形态建成等途径，在山核桃成花过程中发挥着直接或者间接的作用。

陈芳芳通过荧光定量 PCR(gRT-PCR) 技术发现，在山核桃整个雌花芽形成过程中，由于雌花花被缺失，可能造成 CCAPI 基因表达量在多数时期表达量均很低，或几乎不表达，利用原位杂交实验发现，CcLFY在山核桃雌花芽花序原基至雌蕊形成期具有重要作用，并可能影响雌花芽形成后的花器官分化。

杨希宏通过研究山核桃 FLC 同源基因的表达情况和功能鉴定发现，其可能在不同时期具有响应低温调节山核桃休眠期营养和生殖分生组织活性的功能，而且可能在不同时间抑制雌雄花器官的发育。

沈辰分析成花过程转录组数据并利用 gRT-PCR 技术验证发现CcCOPI E3 连接酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，泛素活化酶 E1，泛素蛋白连接酶RIN2-like 和 SPIND *** -like 基因都可能与山核桃雌雄花分化有关。

侯传明和王静静克隆了 CcMADS 基因的开放阅读框，并利用酵母双杂交和蛋白免疫印迹检测发现CCMADS 蛋白可能以多种聚合程度不同的多聚体复合物形式存在并发挥作用。

吴迪和张博利用异源转化拟南芥对山核桃 SVP-like 基因进行了功能验证，过表达植株过花器官产生了不同程度的影响。

这些山核桃开花相关基因的克隆、表达情况分析及功能验证主富了山核桃成花调控机理研究。

随着如高通量测序等测序技术的发展，非编码 RNA 对山核桃成花机理的研究已经取得了相关进展。通过对山核桃雌雄花发育过程的 miRNA 研究，从雄花营养生长至生殖生长过程鉴定到 114 个保守和 5 个新的 miRNA3S>。

而在雌花发育营养生长至生殖生长过程鉴定出41个保守和195 个新的miRNA,差异表达分析发现,保守 miRNA在山核桃花发育过程中发挥着重要的调控作用。

孙志超过表达山核桃的 miR166 和miR171，使拟南芥出现开花提前或推迟、叶片生长发育受阻和分支数减少等现象B36,舒李露过表达 miR169 发现拟南芥植株提前开花。

张博过表达 cca-miR159 前体 cca-miR159.1 使拟南芥阳性植株叶片数量少于野生型，而过表达前体 cca-miR159.2 除了叶片数量减少，其花期较野生型提早。

这些结果都表明在山核桃鉴定出表达特异的miRNA 与花发育存在着一定的关系。

同时通过挖掘山核桃雌雄成花相关 nRNA，张玮筛选获得 6862 个候选 IncRNA，与 miRNA 共表达分析显示总共 63 个 IncRNAs 参与雌性和雄性之间的差异转录 *** 。

其中，LNC 002115 被预测为环境温度变化下山核桃 ptc-miR399f/PHO2 的“诱饵”，其还可以调节 ARF 的表达和影响 ERF 的转录调控，最终影响山核桃雌花发育。

骆甲通过山核桃成花相关 circRNA 的挖掘和鉴定发现，新鉴定 4857 条 circRNA，其中 76 条 circRNA 与开花相关，雌花相关 circRNA可能通过吸附 miR167 参与调控FT 互作蛋白的基因座，雄花相关 circRNA 可能与 ccamiR408-3p、cca-miR2111a 互作，从而参与山核桃花发育。

这些非编码 RNA 的挖掘进一步丰富了我们对山核桃成花分子水平研究。

标签： 酵母 杂交 原理